Kit de prueba de ácido nucleico SARS-CoV-2

Uso previsto:

El kit de prueba de ácido nucleico SARS-CoV-2 se aplica a la detección cualitativa de ácido nucleico de COVID-19 en hisopos nasofaríngeos, hisopos orofaríngeos y esputo. Los resultados de la prueba proporcionan una base de diagnóstico molecular para la infección o la sospecha de pacientes, y no deben utilizarse como único criterio para el diagnóstico clínico.

Materiales:

Procedimiento de prueba:

A. Preparación de la muestra

El ARN extraído es el material de partida para el kit de prueba de ácido nucleico del SARS-CoV-2.

Importante: Cada procedimiento de extracción de ácido nucleico debe realizarse simultáneamente con un control positivo (40 μL, diluir con soluciones salinas estériles / PBS al volumen deseado) y un control negativo (40 μL, diluir con soluciones salinas estériles / PBS al volumen deseado).

Se recomienda utilizar los siguientes kits comerciales de extracción de ácidos nucleicos: PureLinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit (Invitrogen); Mini kit de ARN viral (QIAGEN); TIANamp Hi-DNA/RNA Kit (TIANGEN);

B. Configuración de la mezcla de reacción

1. Todos los reactivos y muestras deben descongelarse por completo, mezclarse completamente y centrifugarse brevemente a temperatura ambiente (intervalo aproximado de 18 a 25 °C) antes de su uso.

2. Prepare el volumen requerido de la mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de tamaño adecuado.

3. Pipetear 25 μL de la mezcla de reacción en cada pozo requerido de una placa de reacción óptica apropiada de 96 pocillos o un tubo de reacción óptica apropiado.

C. Adición de plantillas

1. Añadir 5 μL de ARN extraído de las muestras/ Control positivo/Control negativo. El volumen total es de 30 μL.

2. Mezcle bien las muestras y los controles con la mezcla de reacción mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo / Vórtice.

3. Cierre la placa de reacción de 96 pocillos con las tapas apropiadas o la película adhesiva óptica y los tubos de reacción con las tapas apropiadas.

4. Centrifugue la placa de reacción de 96 pocillos en una centrífuga con un rotor de placa de microtitulación durante 30 segundos a aproximadamente 2500 rpm.

D. Programación del instrumento de PCR en tiempo real

Para obtener información básica sobre la configuración y programación de los diferentes instrumentos de PCR en tiempo real, consulte el manual del usuario del instrumento respectivo. El ensayo ha sido optimizado para el sistema de PCR en tiempo real ABI7500. La ejecución de PCR se realiza con condiciones de ciclismo como se describe en la tabla a continuación.

Definir los detectores de fluorescencia

*Establezca la referencia interna de fluorescencia del instrumento en "Ninguno", por ejemplo: Para los instrumentos de la serie ABI, establezca "Referencia pasiva" en "Ninguno".

Análisis de datos

Establezca los parámetros de análisis y analice los datos de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento de los instrumentos pertinentes.

Tome ABI 7500 como ejemplo:

La línea de base debe establecerse en un rango que elimine la fluorescencia de fondo que se encuentra en los primeros ciclos de amplificación, pero que no se superponga al área donde las señales de amplificación se elevan por encima del fondo (valor de inicio: 3 ~ 10; Valor final: 10-20). El Umbral de Ciclo (Ct) debe estar en la base de la fase exponencial. Haga clic en "Análisis" para obtener el resultado del análisis automáticamente y lea el resultado de la detección en la ventana "Informe".

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